В результате первого года работы по проекту в широтном градиенте (средняя подзона тайги – северная подзона тайги – северная граница северной подзоны тайги) создана сеть постоянных пробных площадей, состоящая из насаждений разных стадий онтогенеза (15-30 лет, 70-80 лет, 180 лет), произрастающих в широком спектре лесорастительных условий (сосняк черничный – сосняк брусничный – сосняк лишайниковый). Подготовлена база данных пробных площадей, включающая полную характеристику биогеоценоза (почва, живой напочвенный покров, древостой). Полученный результат (сеть постоянных пробных площадей) имеет большое значение для будущих долговременных мониторинговых исследований (не только в тематических рамках настоящего проекта).
Впервые на территории Северо-Запада России (средняя подзона тайги) у сосны обыкновенной в разных лесорастительных условиях изучена интенсивность процесса формирования ядровой древесины в зависимости от возраста дерева и возраста камбия в пределах одного дерева. Мы получили, что в сосняке брусничном у сосны обыкновенной продолжительность жизни паренхимных клеток ксилемы колебалась от 10-15 лет у 20-летних растений и до 70 лет у 180-летних деревьев. Скорость образования ядровой древесины (HW) также зависела от возраста дерева. Для 20-30-летних деревьев она составила в среднем 0.3 кольца в год, для 70-80-летних – 0.4-0.5 кольца в год, а для 180-летних растений примерно 0.7 кольца в год. На основании всего массива данных для СБ мы построили модели зависимости количества годичных колец в HW от возраста камбия (С.А.) (√(HW) = a * √(C.A.) + b; Lg(HW) = a * Lg( C.A.) + b). Проверка разработанных моделей на случайно отобранных деревьев сосны показала их успешность для предсказания количество годичных колец в HW. Интенсивность формирования HW в различных лесорастительных условиях была изучена на примере двух контрастных типов леса: сосняка черничного (высокопродуктивный тип леса, формирующийся на почвах с достаточно высоким уровнем плодородия и достаточным количеством почвенной влаги) и сосняка лишайникова (низкопродуктивный тип леса, формирующийся на бедных и сухих почвах). У 80-летних деревьев из сосняка черничного скорость образования HW составила, в среднем, 0.54 годичных кольца в год. Максимальные ее значения наблюдали на высоте ствола от 1.5 до 4.5 м (1 годичное кольцо в год), минимальные – от 4.5 до 10.5 м (в среднем 0.32 годичных кольца за год). Мы получили, что в 70-летнем сосняке лишайниковом ядровая древесина выявлялась вплоть до высоты 4.5 м, на высоте 7.5 м в этом типе леса ядровая древесина в стволах не была обнаружена. В сосняке лишайниковом скорость образования HW у модельных деревьев в среднем составила 0.56 годичных кольца за год. При этом на высоте ствола 1.5-4.5 м ее значения также были наибольшие (0.68 годичных кольца за год). Проверка полученных для сосняка брусничного моделей показала их успешность для предсказания количества годичных колец в HW в сосняке черничном и сосняке лишайниковом. Таким образом, мы получили, что камбиальный возраст и количество годичных колец в HW связаны между собой (для разной высоты ствола в пределах одного дерева, для деревьев разного возраста, для разных лесорастительных условий). Из полученных данных следует важный биологический вывод, что образование ядровой древесины, в большей степени, определяется количеством годичных колец в радиальном ряду ксилемы, то есть неразрывно связано со старением камбиальных клеток.
Процентное содержание HW в стволе взрослых деревьев – это важный показатель не только для характеристики качества древесины, но и для оценки роли сосняков в депонировании углерода. Старовозрастные леса – важнейший элемент сохранения биоразнообразия и глобального стока углерода. Поглощаемый из атмосферы углерод на долгое время депонируется в живых тканях древесных растений, в опаде и т.д. В большинстве исследований при расчете запасов углерода в лесных экосистемах содержание углерода в древесине принято за 50%. Мы показали снижение доли целлюлозы и увеличение доли полимеров фенольной природы (лигнин, экстрактивные вещества) в радиальном ряду «заболонная древесина – переходная зона – ядровая древесина». При этом, растения, произрастающие в разных климатических условиях, не отличались между собой по содержанию исследуемых полимеров. В результате накопления полимеров фенольной природы в ядровой древесине, по сравнение с заболонной древесиной, выше (1) содержание углерода (~ 59%), (2) устойчивость к биодеградации (разложение ядровой древесины при гибели дерева – это более длительный процесс). По нашим данным для сосняка брусничного в стволе (до 10.5 м) у 180-летних растений HW достигает 50 %, у 70-80-летних растений – 30%, расчеты для сосняка черничного показывают, что у 80-летний растений HW уже достигает 45-50%. Мы полагаем, что все вышеперечисленное предполагает особое (в отличие от заболонной древесины) участие ядровой древесины в долговременном депонировании углерода, которое на сегодняшний день до конца не оценено. Дальнейшие исследования в этой области, возможно, позволят пересмотреть роль старовозрастных бореальных лесов в глобальном углеродном балансе.
Мы изучили анатомические особенности зоны перехода между заболонной и ядровой древесиной у сосны в зависимости от возраста дерева в разных лесорастительных условиях. Для этого на радиальных срезах переходной зоны отмечали положение маркерных событий, выявляемых гистохимическими тестами, а именно: (1) изменение окраски торусов окаймленных пор трахеид (в заболонной древесине торусы окаймленных пор окрашивались альциановым голубым, что указывает на присутствие в их составе целлюлозы и пектинов; в ядровой древесине торусы окрашивались сафранином в грязно-розовый цвет из-за отложения на поровой мембране экстрактивных веществ и лигнина); (2) исчезновение крахмальных зерен из клеток лучевой и аксиальной паренхимы; (3) исчезновение ядер из клеток лучевой и аксиальной паренхимы. У всех исследованных деревьев изменение химического состава поровых мембран (ассоциированное с прекращением транспорта воды) и гибель паренхимных клеток происходили в пределах 1-2 соседних годичных колец. При этом химические свойства поровых мембран трахеид изменялись в кольце (либо части годичного кольца), расположенном ближе к периферии ствола, а исчезновение ядер мы наблюдали ближе к центру ствола либо в слое ранней древесины того же годичного кольца, либо в предыдущем годичном кольце. Мы впервые показали, что ширина переходной зоны у всех исследованных деревьев независимо от (1) возраста дерева, (2) типа лесорастительных условий составила от 1 до 2 годичных колец.
В рамках первого года проекта мы изучили экспрессию генов PXY, WOX (WOX13, WOX4, WOXA и WOXG), являющихся паттерами клеточных делений в камбиальной зоне, а также генов, кодирующих эндонуклеазы (BFN, BFN1, BFN2, BFN3) и пептидазы (цистеиновая эндопептидаза, CEP и метакаспаза, MC5) в радиальном ряду «проводящая флоэма, камбиальная зона – дифференцирующаяся ксилема» в период активного камбиального роста на примере деревьев сосны разного возраста: 30-, 70-80- и 180-лет. Мы выявили высокий уровень относительной экспрессии генов семейства WOX в период активного камбиального роста. Мы показали, что WOX4, WOXA и WOXG экспрессировались преимущественно в ксилеме, что говорит об активной пролиферации клеток в этой зоне. WOX13, напротив, показывал большую экспрессию во флоэме, чем в ксилеме. В дифференцирующейся ксилеме исследованных растений всех возрастов мы выявили экспрессию генов, участвующих в ПКС клеток – MC5 и CEP. Экспрессия генов BFN кодирующих эндонуклеазы, как с РНКазной, так и с ДНКазной активностью, была ниже, чем у генов, кодирующих пептидазы. Мы показали, что уровень транскриптов BFN1 и BFN2 преобладал со стороны флоэмы, в то время как экспрессия BFN и BFN3 была выше в дифференцирующейся ксилеме. Получение новых данных позволит нам сравнить молекулярно-генетические механизмы регуляции ПКС в ходе формирования проводящих и механических элементов ксилемы и ПКС паренхимных клеток при формировании ядровой древесины сосны обыкновенной.

Научные результаты 2022 года

Впервые экспериментальным путем выявлен возраст начала формирования ядровой древесины у сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в зависимости от лесорастительных и климатических условий для бореальных лесов Северо-Запада России. Основываясь на определении ядровой древесины (HW), данном IAWA (International Associations of Wood Anatomists), отсутствие ядер в клетках паренхимы использовали как критерий для выявления HW; критерием для выявления переходной (транзитной, TZ) зоны послужило отложение экстрактивных веществ на поровых мембранах, приводящее к их закупорке и прекращению транспорта воды. Все показатели представлены в зависимости от возраста камбия (С.А., количество годичных колец в керне /спиле, отобранных на высоте 03 м). Мы показали, что возраст начала образования HW варьирует от 15 до 17 лет и зависит от условий произрастания. Образование TZ начинается в 9-10 лет, при этом ширина TZ может достигать 4-5 годичных колец. Синтез экстрактивных веществ начинается только в TZ, при этом количество колец с экстрактивными веществами, как правило, меньше количества колец TZ. Ухудшение климатических условий (северная подзона тайги по сравнению со средней подзоной тайги) сопровождается формированием в ксилеме сосны широкой TZ, в которой прекращается транспорт воды и синтезируются экстрактивные вещества, и более ранним образованием HW. В пределах одной климатической зоны увеличение комплексного плодородия способствует более раннему образованию HW и формированию большего количества колец, содержащих экстрактивные вещества.

Для бореальных лесов Северо-Запада России в градиенте климатических (средняя подзона тайги – северная подзона тайги – зона перехода тайги в лесотундру) и лесорастительных (сосняк черничный – сосняк брусничный – сосняк лишайниковый) условий у сосны обыкновенной изучена интенсивность процесса формирования ядровой древесины в зависимости от возраста камбия в пределах одного дерева. На основании большого массива данных построены модели зависимости количества годичных колец в HW от возраста камбия (С.А.): (1) HW = 0.59 * C.A. - 9.6; (2) √(HW) = 0.9 *√(C.A.) – 2.17; (3) Lg(HW) = 1.55 * Lg(C.A.) – 1.46. Количество годичных колец заболонной древесины (SW), как функция от возраста камбия, также описывается линейным уравнением: SW = a * C.A. + b. Мы получили, что лесорастительные и климатические условиями не оказывают существенного влияния на значения коэффициентов a и b. Таким образом, продолжительность жизни паренхимных клеток (количество годичных колец SW) в стволе деревьев сосны, в основном, определяется только возрастом камбия.

Исследованы профили экспрессии CLE41/44-PXY-WOX генов в радиальном ряду «проводящая флоэма / камбиальная зона – дифференцирующаяся ксилема» у P. sylvestris в зависимости от возраста камбия. В рамках проекта получены первые данные о распределении экспрессии генов WOX4 и генов, принадлежащих к древней кладе (PsWOXG и PsWOX13), в тканях ствола P. sylvestris во время камбиального роста. Мы обнаружили, что у растений сосны в период камбиального роста экспрессия PsWOX4 не ограничивалась только камбием (как было показано ранее на примере Arabidopsis), а наблюдалась во всех проанализированных тканях ствола. Экспрессия PsWOX13, в большинстве случаев, была смещена во фракцию, включающую проводящую флоэму и камбиальную зону. Мы обнаружили, что самый высокий уровень транскриптов PsWOX4, PsWOX13 и PsWOXG наблюдался у деревьев, которые характеризовались наибольшим количеством клеток в камбиальной зоне. Показано пространственное разделение экспрессии PsCLE41/44 и PsPXY в тканях ствола сосны. PsCLE41/44 дифференциально экспрессируется во фракции, включающей клетки флоэмы и камбиальной зоны. Максимальная экспрессия гена PsPXY наблюдалась во фракции, включающей дифференцирующиеся клетки ксилемы. Получены первые данные о взаимосвязи возраста камбия, камбиальной активности, CLE41/44-PXY-WOX сигнального пути.

Впервые у P. sylvestris выявлены молекулярные маркеры разных сценариев программированной клеточной смерти (ПКС) при флоэмо-, ксилогенезе и образовании HW. Изучены паттеры экспрессии генов CEP, MC5 (кодируют гидролитические ферменты цистеиновую эндопептидазу и метакаспазу) и генов семейства BFN (кодируют бифункциональную эндонуклеазу, участвующую в деградации клеточного ядра) в тканях ствола по радиальному вектору «F1 (камбиальная зона, проводящая флоэма) – F2 (дифференцирующаяся ксилема) – SWext – SWint (внешние и внутренних слои заболони) – TZ (транзитная зона)». Дифференцировка ситовидных элементов флоэмы (частичный автолиз клеточного содержимого) сопровождалось высокой экспрессией генов BFN1, BFN2. Формирование трахеальных элементов ксилемы (деградация клеточного содержимого) происходит на фоне высокой экспрессии генов CEP, MC5, а также при участии генов семейства BFN. При формировании HW в тканях SW и TZ экспрессия показана только для генов BFN, BFN1, BFN2. Гены BFN3, CEP, MC5 не экспрессировались. Экспрессия генов возрастала в TZ по сравнению с SWint. Наиболее высокий уровень экспрессии в проанализированных тканях был показан для гена BFN. В период покоя в тканях ствола по радиальному вектору «SWex – SWint – TZ» уровень экспрессии BFN, BFN1, BFN2 существенно ниже, по сравнению с периодом камбиального роста. Можно заключить, что этап, связанный с образованием HW (разрушение ядер), в основном, происходит в период камбиального роста.

Впервые у сосны обыкновенной в пространственно-временной динамике изучены биохимические маркеры этапов ксило-, флоэмогенеза и образования HW. Главным биохимическим маркером образования ядровой древесины является синтез экстрактивных веществ, образование которых у сосны начинается в TZ. В период покоя в TZ мы обнаружили экспрессию генов PAL, CHI1, CHI2, CHI3, F3H, STS. Фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ, PAL) катализирует ключевую реакцию в биосинтезе фенольных соединений. Продукт этой реакции – транс-коричная кислота – может включаться в путь биосинтеза лигнина. Халконизомераза (CHI) и стильбенсинтаза (STS) – ферменты фенилпропаноидного пути; первый обеспечивает направление, связанное с образованием гидролизуемых и конденсированных танинов, второй – биосинтез основного компонента экстрактивных веществ сосны из класса стильбенов – пиносильвина. В SWint были обнаружены транскрипты только для генов PAL, CHI1, STS, количество их было существенно ниже, по сравнению с TZ. В период покоя утилизация сахарозы как в SW, так и в TZ происходит с участием апопластной (АпИнв) и вакуолярной (ВакИнв) инвертаз.

В период камбиального роста в F2 преобладают процессы, связанные с дифференцировкой камбиальных производных в трахеиды, при этом метаболизация сахарозы происходит, в основном, за счет сахарозосинтазы. В SW повышается активность ПФО (полифенолоксидазы), которая участвует в биосинтезе лигнина. Утилизация сахарозы в SW происходит с участием АпИнв и ВакИнв. Высокая активность ФАЛ в F2 и SW обеспечивает переключение метаболических путей на вторичный метаболизм.

Мы рассмотрели варианты утилизации перекиси водорода в тканях ствола сосны. В период камбиального роста в дифференцирующейся ксилеме образовавшаяся в ходе суперокиддисмутазной реакции перекись водорода активно метаболизируется за счет КАТ и ПОД (совместная работа СОД/КАТ/ПОД). В SW на фоне возрастания активности СОД (увеличивается образование Н2О2) не наблюдается повышения активностей КАТ и ПОД. Высокая активность ФАЛ (источник транс-коричной кислоты) и ПФО (источник фенольных соединений) обеспечивают совместную работу СОД/ФАЛ/ПФО. В период покоя перекись водорода, образованная в результате супероксиддисмутазной реакции в SW и TZ, метаболизируется, в основном, каталазой (совместная работа СОД/КАТ).

На основании полученных данных предложены метаболические схемы, отражающие процессы, происходящие в тканях ксилемы при образовании ядровой древесины, которые при получении новых данных будут дополняться.

Научные результаты 2023 года

Впервые для бореальных лесов Северо-Запада России в градиенте климатических (средняя подзона тайги – северная подзона тайги – зона перехода тайги в лесотундру) и эдафических (сосняк черничный – сосняк брусничный – сосняк лишайниковый) условий у сосны обыкновенной изучена интенсивность процесса формирования ядровой древесины в зависимости от возраста камбия в пределах одного дерева. Выявлено, что камбиальный возраст и количество годичных колец в ядровой древесине (HW) связаны между собой (для разной высоты ствола в пределах одного дерева, для деревьев разного возраста, для разных лесорастительных условий). Построены модели зависимости количества годичных колец в HW от возраста камбия.

Впервые дана характеристика транзитной зоны (TZ) у деревьев сосны обыкновенной разного возраста в зависимости от лесорастительных условий. Показано, что ширина TZ у всех исследованных деревьев независимо от возраста дерева, типа лесорастительных условий составила от одного до двух, в редких случаях трех, годичных колец. Высказано предположение, что постоянство в ширине транзитной зоны в различных типах леса и у деревьев разного возраста указывает на то, что переход заболоннной в ядровую древесину регулируется эндогенными механизмами развития.

Впервые экспериментальным путем выявлен возраст начала формирования ядровой древесины у P. sylvestris в зависимости от лесорастительных условий для бореальных лесов Северо-Запада России. Показано, что возраст начала образования HW варьирует от 15 до 17 лет и зависит от условий произрастания. Результат важен для понимания закономерностей формирования HW и разработки реалистичных моделей этого процесса, в том числе в условиях изменяющегося климата.

Выявлены зависимости между возрастом камбия, камбиальной активностью и продолжительностью жизни клеток лучевой паренхимы. Количество клеток в камбиальной зоне служит хорошим анатомическим критерием активности камбия. Впервые выявлено пространственное и временнóе распределение активности компонентов сигнального модуля CLE41/44-PXY-WOXs, регулирующего камбиальную активность. Высокая камбиальная активность наблюдалась на фоне повышенной экспрессии PsWOX4 в зоне ксилемных производных камбия, которой во времени предшествовало накопление транскриптов PsCLE41/44 во флоэме. Возрастание транскриптов PsPXY в дифференцирующейся ксилеме и зрелой ксилеме текущего года происходило в период утолщения вторичных клеточных стенок и дифференциации поздних трахеид, а максимальный его уровень приходился на окончание камбиальных делений. На основании полученных результатов и данных литературы предложена схема, демонстрирующая влияние CLE41/44-PXY сигналинга и ауксинового сигналинга на WOX4 у древесных растений.

Показано, что с увеличением возраста камбия снижается камбиальная активность. Образование бóльшего количества клеток молодым камбием обусловлено более интенсивными делениями камбиальных инициалей и/или их производных. Высказано предположение, что причина бóльшей камбиальной активности молодого камбия – это повышенный CLE41/44-PXY сигналинг (пролиферация камбиальных инициалей и их производных) на фоне ауксинового сигналига (дифференциация ксилемных производных камбия).
Показано снижение продолжительности жизни клеток лучевой паренхимы по направлению от основания к вершине ствола. При этом, доля HW от общей площади ствола и расстояние от камбиальной зоны до границы HW существенно не изменялись по высоте ствола (в зависимости от возраста камбия). То есть старение и программируемая клеточная смерть (ПКС) клеток лучевой паренхимы независимо от возраста камбия начинались примерно на одном и том же расстоянии от камбиальной зоны.

Молекулярным маркером ПКС служит экспрессия генов семейства BFN, кодирующих бифункциональные эндонуклеазы. Показано значимое увеличение уровня экспрессии генов PsBFN и PsBFN1 при переходе от внутренних слоев SW к TZ. Продемонстрировано, что переход TZ в HW (разрушение ядер) начинается в период камбиального роста и прекращается в период подготовки к покою, в этот период начинается переход внутренней SW к TZ.

Выявлена отрицательная корреляция возраста камбия и уровня экспрессии PsBFN и PsBFN1 в TZ. Выдвинуто предположение об увеличении числа клеток, подвергающихся ПКС, у молодого камбия для поддержания ширины заболонной древесины, поскольку количество клеток, образуемых молодым камбием, а, следовательно, и ширина годичного кольца превосходят таковые у более зрелого камбия. Таким образом, существует положительная связь количества клеток ксилемы, вновь образованных в текущем году, и интенсивности формирования ядровой древесины. Для подтверждения этого предположения необходимы дальнейшие исследования.

Изучены метаболические перестройки основных обменных процессов, предшествующие образованию HW. Выявлена роль системы СОД/КАТ/ПОД в утилизации АФК в тканях ствола по радиальному вектору «проводящая флоэма, камбиальная зона (F1) – ксилема на разных стадиях дифференцировки (F2) – заболонная древесина (SW) – транзитная зона (TZ)» в зависимости от фенологического состояния (камбиальный рост – подготовка к покою – покой). Высокая активность СОД на начальных этапах ксилогенеза связана с распределением кислорода и образующихся из него активных форм от периферии к центру ствола. Так, молекулярный кислород поступает к клеткам флоэмы, камбия и ксилемы в основном с транспирационным током воды по ксилеме. В утилизации образующегося Н2О2 основная роль принадлежит КАТ. Снижение доступности почвенной влаги во второй половине вегетационного периода (утолщение вторичных клеточных стенок и начало формирования поздних трахеид) приводит к падению активности СОД и КАТ в SW. При этом, в тканях F1 – F2 – SW возрастает роль ПОД в метаболизации Н2О2, что может быть связано с участием ПОД в лигнификации вторичной клеточной стенки.

В период камбиального роста в дифференцирующейся ксилеме и заболонной древесине преобладает метаболизация сахарозы по сахарозосинтазному пути. Падение активности СС в период формирования поздних трахеид сопровождается возрастанием АпИнв и ПОД и связано с повышением роли шикиматного пути. Происходит увеличение экспрессии PAL, кодирующего фенилаланинаммиак-лиазу, которая катализирует превращение конечного продукта шикиматного пути – фенилаланина в транс-коричную кислоту. Последняя через фенилпропаноидной путь служит предшественником большинства фенольных соединений, а также полимера фенольной природы лигнина. Ключевые игроки фенилпропаноидного пути – халконсинтаза (CHS), халконизомераза (CHI) и стильбенсинтаза (STS). Первые два обеспечивают направление, связанное с образованием гидролизуемых и конденсированных танинов, последний – биосинтез основного компонента экстрактивных веществ сосны – пиносильвина. Экспрессия, кодирующих их генов обнаружена на всех этапах камбиального роста в SW и TZ. При подготовке к покою количество транскриптов этих генов снижается. Таким образом, можно заключить, что основная масса экстрактивных веществ образуется в период камбиального роста, предшествуя ПКС.

Впервые для бореальных лесов Северо-Запада России в градиенте климатических (средняя подзона тайги – северная подзона тайги – зона перехода тайги в лесотундру) и эдафических (сосняк черничный – сосняк брусничный – сосняк лишайниковый) условий у сосны обыкновенной изучены особенности накопления экстрактивных веществ в HW. Показано, что у доминирующих 80-летних деревьев сосны обыкновенной, произрастающих в разных типах леса (СЧ, СБ, СЛ) средней подзоны тайги, содержание экстрактивных веществ в HW превышало таковое в SW на 4.2, 5.0 и 9.6 % соответственно. В градиенте климатических условий также содержание экстрактивных веществ в HW превышает таковое в SW. Экстрактивные вещества – это богатые углеродом полимеры, в связи с чем возрастание их содержания сопровождается увеличением содержание углерода в HW. Данные о накоплении экстрактивных веществ, в зависимости от условий произрастания, могут быть использованы для оценки вклада HW в аккумуляцию углерода стволовой древесиной.